|
鉴定内容：
|
结直肠癌在发达国家是第三种最常见的恶性肿瘤,也是致死的第二种恶性肿瘤, 近20余年我国结直肠癌发病率明显增高。流行病学调查结果指出，我国直肠癌发病率及病死率呈上升的趋势。同时具有高发病率、高病死率、和高复发率的特点，而且发病且愈来愈年轻化，它的高死亡率和致残率严重威胁着人类的身体健康和生活质量。在结直肠癌的治疗中,以手术为主的综合治疗虽已取得较好疗效，但对于晚期及伴有转移的患者，欲获得理想的疗效有待于其他治疗的进一步发展。作为一种有潜力的生物治疗的手段，RNA干扰几度被评为世界科技热点新闻，RNA 干扰技术可以高效地、特异地抑制目的基因，这对于肿瘤靶向治疗非常重要。随着现代分子生物学的不断发展，尤其是DNA重组技术和基因转移技术的逐步成熟，RNA 干扰技术对肿瘤的治疗成为极有发展前景的治疗新方法。 c-myc基因是人们发现较早的一种原癌基因，c-myc蛋白是一种具有DNA结合功能的转录因子，启动细胞增殖，抑制细胞分化，参与细胞凋亡。人类许多肿瘤可检测到c-myc基因的异常表达，如白血病、胃癌、结直肠癌等。资料表明：在正常结直肠中，c-myc基因低表达或不表达，在原发性结直肠癌组织及癌周组织中 myc蛋白表达水平显著性升高。c-myc蛋白表达与结直肠癌的发生、发展密切相关，而且与结直肠癌的分期、预后有关。研究表明：端粒酶激活与结直肠癌的发生密切相关，近年来随着对端粒酶与肿瘤关系的研究深入。认为端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase，hTERT)可能在端粒酶活性调节中发挥重要作用。人类细胞端粒酶含有多个蛋白质亚单位，其中人端粒酶逆转录酶在肿瘤细胞中表达明显增强，在正常细胞中受到抑制，其表达水平与端粒酶活性显著相关，对端粒酶活性表达起限速作用。最近的研究发现hTERT被激活与c-myc的高表达密切相关。 在这里，我们拟利用小链RNA干扰技术，将发夹状小链RNA(shRNA)的封闭靶点定位在与细胞恶性增殖相关、调控细胞端粒酶活性及端粒DNA长度关键基因c-myc，以期通过shRNA干扰c-myc基因表达，研究shRNA对结直肠癌Colo320细胞c-myc基因的封闭及抑制效果。同时，探讨c-myc靶向siRNA调控Colo 320细胞hTERT及端粒长度的分子机制。研究中，我们根据c-myc基因序列(NM_002467)以及真核表达载体pGenesil-1的MCS，http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html在线设计30对引物，根据shRNA设计规则及blast同源搜索选取3－4对引物及设计一对对照引物,每一对引物上游含BamHⅠ切点之后的GATCC的粘性末端，引物下游互补端含HindⅢ切点互补的TTCGA粘性末端，将pGenesil-1和c-myc基因的shRNA四对引物片段,经BamHⅠ，HindⅢ双酶切后,再线性连接，构建真核表达质粒pGenesil-1-c-myc1-4。将真核表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,小量提取质粒测序鉴定。用Lipofectamine 2000包裹真核表达质粒并转染结直肠癌Colo320细胞。 通过对（1） c-myc的shRNA对转染细胞前后的增殖影响的检测，主要有：① 通过对Cell counts 与DNA synthesis 实验研究，观察转染细胞前后生长与增殖状况。② 通过集落形成试验观察、比较转染细胞前后所形成的克隆形成率。③ 流式细胞仪分析转染细胞前后细胞周期变化。④ Western blot 检测 caspase 3 、PARP 蛋白量，比较转染细胞前后凋亡状况。（2） c-myc的shRNA对转染细胞的c-myc、hTERT基因及蛋白表达影响的检测，主要有：① 运用荧光定量PCR技术检测转染细胞前后c-myc、hTERT基因的mRNA的表达。② western blot检测转染细胞前后c-myc、hTERT的蛋白表达。（3）c-myc的shRNA对转染细胞的端粒长度、端粒酶活性影响的检测 ①telomere restriction fragment (TRF) length检测细胞端粒长度。 ②PCR-ELISE检测细胞端粒酶活性。证实是否成功的构建c-myc的shRNA的真核表达载体，并在 Colo320细胞中表达？观察c-myc的shRNA是否抑制人Colo320细胞的生长, 其抑制作用是否可能通过阻断c-myc蛋白表达实现？观察c-myc的shRNA是否诱导发生细胞凋亡以及hTERT基因表达的变化？观察Colo320细胞在c-myc的shRNA作用下，其端粒、端粒酶是否发生改变？实验结果为进一步研究c-myc的shRNA对人结直肠癌的基因治疗提供理论依据，并从逆向角度进一步探讨c-myc对hTERT基因表达的调控作用
|
